在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響,即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,抗原抗體反響的完結(jié)需求有一定的溫度和時(shí)刻,這一保溫進(jìn)程稱(chēng)為溫育,有人稱(chēng)之為孵育,在ELISA試劑盒中似不恰當(dāng)。
1. 為什么ELISA反響總是需求一定時(shí)刻的溫育?
ELISA屬固相免疫測(cè)定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標(biāo)本,其間的抗原并不是都有平等的和固相抗結(jié)合的時(shí)機(jī),只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,這是一個(gè)逐步平衡的進(jìn)程,因而需經(jīng)擴(kuò)散才能到達(dá)反響的結(jié)尾。在這以后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。
2. 溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃等。
37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度,在建立ELISA方法作反響動(dòng)力學(xué)研究時(shí),實(shí)驗(yàn)表明,兩次抗原抗體反響一般在37℃經(jīng)1~2小時(shí),產(chǎn)品的可達(dá)高峰。為加快反響,可進(jìn)步反響的溫度,有些實(shí)驗(yàn)在43℃進(jìn)行,但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為,在放射免疫測(cè)定中多使反響在冰箱中過(guò)夜,以構(gòu)成多的沉淀。但因所需時(shí)刻太長(zhǎng),在ELISA試劑盒中一般不予選用。
ELISA試劑盒保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,一般均選用水浴,可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中,ELISA板底應(yīng)貼著水面,使溫度敏捷平衡。為防止蒸騰,板上應(yīng)加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,此時(shí)可讓反響板漂浮在水面上。若用保溫箱,ELISA試劑盒應(yīng)放在濕盒內(nèi),濕盒要選用傳熱性良好的資料如金屬等,在盒底墊濕的紗布,后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)則的溫度,特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。
無(wú)論是水浴仍是濕盒溫育,反響板均不宜疊放,以確保各板的溫度都能敏捷平衡。室溫溫育的反響,操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)厲限制在規(guī)則的范圍內(nèi),規(guī)范室溫溫度是指20~25℃,但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí),ELISA試劑盒只需平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)留意溫育的溫度和時(shí)刻應(yīng)按規(guī)則力求準(zhǔn)確。為確保這一點(diǎn),一個(gè)人操作時(shí),一次不宜多于兩塊板一起測(cè)定。